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GBT 18204.4-2013 公共場(chǎng)所衛生檢驗方法 第4部分:公共用品用具微生物.pdf
1、范圍
GB/T 18204的本部分規定了公共場(chǎng)所公共用品用具細菌總數、真菌總數、大腸菌群、金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌的采樣與測定方法。
本部分適用于公共場(chǎng)所內公共用品用具細菌總數、真菌總數、大腸菌群、金黃葡萄球菌以及溶血性鏈球菌的測定,其他場(chǎng)所可參照執行。
2、術(shù)語(yǔ)和定義
下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。
2.1
細菌總數total bacterial count
公共用品用具經(jīng)過(guò)采樣處理,在營(yíng)養瓊脂培養基上經(jīng)35℃~37 ℃,48 h培養所生長(cháng)發(fā)育的嗜中溫性需氧和兼性厭氧菌落的總數。
2.2
大腸菌群coliforms
在37 ℃,24 h培養能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣.需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌2.3
金黃色葡萄球菌staphylococcus aureus
在Baird Parker培養基或血平板培養基上生長(cháng)良好,分解甘露醇產(chǎn)酸,血漿凝固酶陽(yáng)性的革蘭氏陽(yáng)性葡萄狀球菌。
2.4
真菌總數total fungi count
在孟加拉紅或沙氏瓊脂培養基上經(jīng)25笆?28 °C、3 d?7 d培養所形成菌落的總數。
2.5
溶血性鏈球菌 streptococcus hemolyticus
屬于鏈球菌屬,為革蘭氏陽(yáng)性菌,分解葡萄糖,產(chǎn)酸不產(chǎn)氣,血平板上產(chǎn)生溶血圈。
在孟加拉紅或沙氏瓊脂培養基上經(jīng)25 ℃~28 ℃、3 d~7 d培養所形成菌落的總數。
3、細菌總數平皿計數法
3.1培養基與試劑
3.1.1 生理鹽水成分:
氯化鈉 8.5 g
蒸餾水 1 000 mL
制法:稱(chēng)取8.5 g氯化鈉溶于1000 mL蒸餾水中,分裝到試管內,每管10 mL,121℃高壓滅菌15 min。
3.1.2營(yíng)養瓊脂成分:
蛋白臉
牛肉膏
氯化鈉
瓊脂
蒸餡水
制法:將上述成分混合后,加熱溶解,調整pH為7. 4?7.6,分裝于玻璃容器內,經(jīng)103.43 kPa (121 °C ,15 lb)滅菌20 min,儲存于冷暗處備用。
3.2儀器和設備
高壓蒸汽滅菌器°
樣品的稀釋:將放有采樣后棉拭子的試管充分振搖,此液為1 : 10的樣品勻液。用1 mL無(wú)菌吸 管或微量移液器吸取1 : 10樣品勻液1 mL,沿管壁緩慢注于盛有9 mL生理鹽水稀釋液(3.1.1)的無(wú)菌 試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖試管或換用1支無(wú)菌吸管反復吹打使其混合均 勻,制成1 : 100的樣品勻液。按同法制備10倍系列稀釋祥品勻液,每遞增稀釋1次,換用1次1 mL無(wú) 菌吸管或吸頭。
3.3.3樣品的接種:根據對樣品污染狀況的估計,選擇1個(gè)?2個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液,在進(jìn)行10倍 遞增稀釋時(shí),每個(gè)稀釋度分別吸取1 mL樣品勻液于2個(gè)無(wú)菌平皿內。同時(shí)分別取1 mL稀釋液加入兩 個(gè)無(wú)菌平皿作空白對照。
334樣品的培養:及時(shí)將15 mL?20 mL冷卻至45 °C?50 °C的平板計數瓊脂培養基(可放置于 46 °C±1 °C恒溫水浴箱中保溫)傾注平皿,并轉動(dòng)平皿使其混合均勻。瓊脂凝固后,將平板翻轉, 36 °C±1 °C培養 48 h±2 h。
干熱滅菌箱。
恒溫培養箱:36笆士1 °C。
冰箱。
電爐或微波爐。
天平:感量0.1 go 渦旋混合器。
無(wú)菌試管、平皿(直徑9 cm)、刻度吸管等& 滅菌棉拭子。
滅菌剪刀。
pH計或精密pH試紙。
放大鏡或(和)菌落計數器。
3.3檢驗步驟
3.4菌落計數 3.4.1可用肉眼觀(guān)察,必要時(shí)用放大鏡或菌落計數器,記錄稀釋倍數和相應的菌落數量(CFU)。
3.4.2選取菌落數在30 CFU?300 CFU之間、無(wú)蔓延菌落生長(cháng)的平板計數菌落總數。低于30 CFU 的平板記錄具體菌落數,大于30。CFU的可記錄為多不可計。每個(gè)稀釋度的菌落數應采用兩個(gè)平板的 平均數。
3-4.3其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(cháng)時(shí),則不宜釆用,而應以無(wú)片狀菌落生長(cháng)的平板作為該稀釋
2度的菌落數;若片狀菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均勻,即可計算半個(gè)平板后乘以
2,代表一個(gè)平板菌落數。
3.4.4平板內如有鏈狀菌落生長(cháng)時(shí)(菌落之間無(wú)明顯界限),應將每條鏈(不同來(lái)源)作為一個(gè)菌落計。
3.5不同稀釋度菌落計數計算規則
3.5.1若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數在適宜計數范圍內,計算兩個(gè)平板菌落數的平均值,再將均 值乘以相應稀釋倍數,作為每毫升中菌落總數結果。
3.5.2若有兩個(gè)連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內時(shí),則總菌落數按式(1)計算,示例見(jiàn)表 2 SC
4大腸菌群多管發(fā)酵法
4.1培養基和試劑 4.1.1乳糖膽鹽發(fā)酵培養液
成分:
蛋白臃
豬膽鹽(或牛、羊膽鹽)
乳糖
漠甲酚紫水溶液(質(zhì)量濃度= 0.04%)
蒸館水
制法:將蛋白臉、膽鹽及乳糖溶于蒸儲水中,調pH至7.4,加漠甲酚紫溶液,混勻,分裝到帶有倒管 的試管中,每管10 mLo經(jīng)68.96 kPa(115 °C ,10 lb)高壓滅菌20 mino
注:雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管除蒸儲水外,其他成分加倍。
4.1.2伊紅美藍瓊脂
成分:
蛋白臃
乳糖
磷酸氫二鉀
瓊脂
伊紅水溶液(質(zhì)量濃度=2 % )
美藍水溶液(質(zhì)量濃度= 0.5%)
蒸儲水
制法:將蛋白臉、磷酸鹽和瓊脂溶解于蒸館水中,調整pH至7.2,分裝到燒瓶?jì)?。?jīng)68.96 kPa (115 °C ,10 lb)高壓滅菌20 min,臨用時(shí)加入乳糖并加熱熔化瓊脂,冷至50 °C~55 加入伊紅和美藍 溶液,搖勻,傾注平皿。
4.1.3乳糖發(fā)酵管
成分:
蛋白腺 20
乳糖 10
漠甲酚紫水溶液(質(zhì)量濃度-0.04%) 25
蒸館水
制法:將蛋白腺及乳糖溶于水中,調pH至7.4,加入指示劑,分裝到帶有倒管的試管中,每管3 mL, 經(jīng) 68.96 kPa(115 °C,10 lb)高壓滅菌 20 mino 4.1.4革蘭氏染色液 4.141結晶紫染色液
成分:
結晶紫
乙醇(95%,體積分數)
5金黃色葡萄球菌平皿鑒定法
5.1培養基和試劑
5.1.1胰酪陳大豆肉湯
成分:
胰酪豚(或胰蛋白蹤)
植物蛋白豚(或大豆蛋白蹤)
氯化鈉
磷酸氫二鉀
葡萄糖
蒸饞水
制法:將上述成分混合后,加熱溶解,調pH為7.2?7.3,分裝,121 °C、20 min高壓滅菌。
結果報告
凡在上述選擇平板上有可疑菌落生長(cháng),經(jīng)染色鏡檢,證明為革蘭氏陽(yáng)性葡萄球菌,血漿凝固酶試驗 陽(yáng)性,可報告檢出金黃色葡萄球菌。